API Test مدل انتروتیوب (Enterotube)

هدف:

API Test مدل انتروتیوب (Enterotube) محصول تولیدی از شرکت مشهد ژن آزما می باشد. انتروتیوب یک سیستم شناسایی آماده می باشد که حاوی محیط های کشت ویژه برای شناسایی باسیل های گرم منفی بیماریزا در آزمایشگاه میکروب شناسی می باشد.

در ویدیو زیر شما با نحوه انجام تست و تفسیر آن در آزمایشگاه میکروبشناسی آشنا می شوید. لازم به ذکر است که این محصول برای اولین بار در ایران توسط شرکت مشهد ژن آزما طراحی و بومی سازی شده است.

اصول و توضیح فرایند:

انتروباکتریاسه ها به همراه سایر باسیل های گرم منفی به عنوان عوامل عفونی نقش عمده ای در عفونت ها دارند. این گروه از باکتری ها از کربوهیدرات ها عمدتاً از طریق تخمیر و اکسیداسیون استفاده می کنند. این شناسایی بر اساس واکنش های بیوشیمیایی است که توسط Ewing و Farmer شرح داده شده است. در حالی که طی سال‌ها تنوع زیادی از جنس‌ها و گونه‌ها توصیف شده است، ارگانیسم‌هایی که از نمونه‌های بالینی جدا شده‌اند متعلق به 20 تا 25 گونه هستند که برای سال‌ها شناخته شده هستند.

GNB-API یک لوله پلاستیکی محفظه ای است که حاوی ده محیط مختلف است و امکان تعیین 11 واکنش بیوشیمیایی شامل سیترات، اوره، مالونات، لاکتوز، مانوز، آرابینوز، اندل، سولفید هیدروژن (H2S)، لایزین، اورنیتین و گلوکز را فراهم می کند.

سیم تلقیح داخل سیستم، این امکان را بوجود می آورد تا تمام محفظه ها در طی یک مرحله از یک یا چند کلنی منفرد تلقیح شوند. ترکیب حاصل از تغییر واکنش ها همراه با کدهای تشخیصی، امکان شناسایی انتروباکتریاسه و سایر گرم منفی های بالینی مهم را فراهم می کند.

روش انجام کار:

برای تلقیح  GNB-API، باکتری رشد کرده بر روی محیط های مک کانکی آگار (MAC)، ائوزین متیلن بلو (EMB)، سالمونلا شیگلا (SS)  آگار، هکتون انتریک آگار  (HE)یا از محیط های آگار غیرانتخابی می تواند استفاده شود. کشت مورد استفاده برای تلقیح باید حداقل 18 ساعت باشد، اما به طور کلی نباید بیشتر از 48 ساعت باشد. مطمئن شوید که کلنی که باید با GNB-API شناسایی شود، کشت خالص از باسیل گرم منفی است. روش انجام کار مطابق با شکل 1 بصورت زیر می باشد:

1. با وارد کردن نام بیمار، شماره نمونه و تاریخ، یک برگ از صفحه کدگذاری برای ایزوله آماده کنید.
2. یک لوله GNB-API بردارید و نام بیمار، شماره نمونه و تاریخ را روی برچسب وارد کنید.
3. هر دو درپوش را بردارید. نوک سیم تلقیح را بر روی شعله نگیرید.
4. مستقیماً با نوک سیم تلقیح یک یا دو کلنی تک را انتخاب کنید (شکل1-A). مقدار قابل مشاهده ای از تلقیح باید در نوک و کنار سیم دیده شود. از لمس آگار با سیم خودداری کنید.
5. GNB-API را ابتدا با چرخاندن سیم به بیرون کشیده تا سیم از تمام 10 محفظه با اعمال یک حرکت چرخشی تلقیح شود (شکل1-B).
6. مجدداً سیم (بدون استریل کردن) را 1-2 بار با استفاده از حرکت چرخشی در تمام 10 محفظه وارد و خارج کنید تا باکتری بطور کامل در محیط ها تلقیح شود.
7. سپس محل بریدگی سیم (نزدیک به انتهای سیم) را با دهانه لوله تراز کرده و با خم کردن، سیم را در محل بریدگی شکسته (شکل1-C).
8. با قسمت جدا شده سیم، سوراخ هایی را در ورودی هوای شش محفظه آخر (آرابینوز، مانوز، لاکتوز، مالونات، اوره و سیترات) ایجاد کنید (شکل1-D). رشد هوازی در این محفظه ها صورت می گیرد. سپس هر دو درپوش را ببندید.
9. در دمای 35 تا 37 درجه سانتیگراد به مدت 18 تا 24 ساعت در حالی که GNB-API روی سطح صاف یا در وضعیت عمودی قرار دارد انکوبه کنید. اجازه دهید تا هوا بین لوله های انکوبه شده گردش کند (شکل1-E).
10. بعد از 24 ساعت، تمام واکنش ها به استثناء تست اندول را تفسیر و یادداشت کنید. (برای دستورالعمل‌های کامل در مورد نحوه خواندن نتایج GNB-API، به بخش نتایج مراجعه کنید.) همه آزمایش‌های دیگر باید قبل از انجام آزمایش‌ اندول خوانده شوند.
11. برای انجام آزمایش اندول: 2 تا 3 قطره از معرف کواکس را تهیه و به محفظه H2S/indole اضافه کنید. اجازه دهید معرف با سطح محیط تماس پیدا کند. آزمایش مثبت با ایجاد رنگ قرمز در معرف اضافه شده در عرض 10 ثانیه نشان داده می شود.

شکل1: نحوه انجام تست در 5 مرحله بصورت شماتیک نمایش داده شده است.

نتایج:

دستورالعمل های زیر را برای شناسایی ایزوله دنبال کنید. اطلاعات مربوط به واکنش های مثبت و منفی ترکیبات در جدول 1 ارائه شده است.

1. پس از 18 تا 24 ساعت انکوباسیون، تمام واکنش ها به استثناء تست اندول تفسیر و یادداشت شود. با مقایسه رنگ‌های محیط داخل لوله پس از انکوباسیون با رنگ‌های موجود در جدول1 و (در نهایت) با یک GNB-API بدون تلقیح، واکنش‌ها به صورت متوالی بصورت مثبت یا منفی خوانده می شود. تمام واکنش هایی که باید مثبت باشند ممکن است با شدت برابر، بیشتر یا کمتر صورت گیرد.
2. هر یک از نتایج مثبت تست را با دایره کشیدن عددی که در زیر محفظه مربوطه روی صفحه نتایج مشخص شده است علامت بزنید (شکل 2)
3. در نهایت تست اندول را انجام دهید. در صورت مثبت بودن، روی برگه نتایج دایره بزنید.
4. اعداد دایره شده در هر قسمت را جمع کنید و مجموع را در فضای زیر فلش وارد کنید (شکل3).
5. شماره چهار رقمی را با استفاده از جدول 2 بیابید. در مثال ارائه شده در شکل 3، ایزوله انجام شده به عنوان اشریشیا کلی شناسایی شده است.

نحوه کدگذاری:

کدهای تشخیصی برای GNB-API با استفاده از داده های درصد موجود در مراجع برای آزمایش های بیوشیمیایی انجام شده توسط GNB-API ساخته شده است. نحوه تفسیر تست GNB-API به این صورت می باشد که کدها در تست های 3تایی (به استثناء 2 تست آخر که بصورت دوتایی خوانده می شوند) تقسیم بندی شده اند که هر کدام به ترتیب دارای کد 4، 2 و 1 می باشد. سپس با جمع زدن اعداد موجود، یک عدد 4 رقمی بدست می آید که بصورت یک کد واحد قابل شناسایی می باشند (شکل2). در مواردی که دو یا چند میکروارگانیسم ذکر شده باشد، آزمایش های تاییدی مورد نیاز برای شناسایی بیشتر آنها نیز الزامی می باشد.

شکل2: نحوه کد گذاری 4 رقمی برای تشخیص باسیل های گرم منفی

ذخیره سازی و ماندگاری:

پس از دریافت، GNB-API را در تاریکی در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد، در جعبه اصلی تا قبل از استفاده نگهداری کنید. از یخ زدگی و گرمای بیش از حد خودداری کنید. لوله ها را می توان تا تاریخ انقضا تلقیح و برای مدت 18-24 ساعت انکوبه کرد. تست های باز شده باید بلافاصله استفاده شوند.